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*** 1.1 实验方法 免疫荧光（双标，组织芯片） 依次将切片放入环保型脱蜡液I 10min-环保型脱蜡液II 10min-环保型脱蜡液III 10min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-无水乙醇Ⅲ5min-蒸馏水洗。抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（PH8.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中火8min停火8min转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(修复液和修复条件根据组织来确定）画圈,双氧水封闭：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），切片放入3%双氧水溶液，室温避光孵育25 min，封闭内源性的过氧化物酶，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。血清封闭: 甩干PBS, 滴加BSA，封闭30min。（一抗是山羊来源用10%兔血清封闭，一抗其它来源的用3%BSA封闭）加第一种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。 加CY3-TSA（或FITC-TSA）：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加TSA，避光室温孵育10min. 孵育完后，玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min微波处理：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（PH8.0）的修复盒中于微波炉内加热处理，中火8min停火8min转中低火7min，去掉已经结合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。 加第二种一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）。 加对应的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的荧光二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。 DAPI复染细胞核：切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。 自发荧光淬灭：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后，在圈内加入自发荧光淬灭剂5min，流水冲洗10min。 封片：切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。 镜检拍照：切片于荧光显微镜下观察并采集图像。 免疫组化（组织芯片） 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入脱蜡液Ⅰ 15min-脱蜡液Ⅱ 15min-脱蜡液III 15min-无水乙醇Ⅰ 5min-无水乙醇Ⅱ 5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸馏水洗。 抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液（PH6.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火8min至沸，停火8min保温再转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。阻断内源性过氧化物酶：切片放入3%双氧水溶液，室温避光孵育25 min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。血清封闭:在组化圈内滴加3%BSA 均匀覆盖组织，室温封闭30min。（一抗是山羊来源的用兔血清封闭，其他来源的用BSA封闭） 加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发） 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗（HRP标记）覆盖组织，室温孵育50min。 DAB显色：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。复染细胞核：苏木素复染3min左右，自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。 脱水封片：将切片依次放入75%酒精5min--85%酒精5min --无水乙醇Ⅰ 5min --无水乙醇Ⅱ 5min--正丁醇5min--二甲苯Ⅰ 5min 中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，封片胶封片。显微镜镜检，图像采集分析。 荧光分析（组织芯片数字扫描） 通过扫描浏览软件 （3DHISTECH（Hungary） CaseViewer2.4）对其进行AI分析得到阳性面积，阳性率等相关芯片组化数据 组化分析（组织芯片数字扫描） 通过扫描浏览软件 （3DHISTECH（Hungary） CaseViewer2.4）对其进行AI分析得到MVP，H-Score等相关芯片荧光数据 透射电镜全套 取材固定：新鲜组织确定取材部位，尽量减小牵拉、挫伤与挤压等机械损伤，1-3min内取样，取样组织1mm3大小。取材前可提前准备装有电镜固定液的培养皿，将小组织块离体取下后立即投入培养皿内，用手术刀在培养皿的固定液中进行切割成1mm3的小组织块。再将切割好的小组织块转移至装有新的电镜固定液的EP管内继续固定，4℃固定保存及运输。0.1M磷酸缓冲液PB（PH7.4）漂洗3次，每次15min。后固定：0.1M磷酸缓冲液PB（PH7.4）配制的1%锇酸避光室温固定2h。0.1M磷酸缓冲液PB（PH7.4）漂洗3次，每次15min。 室温脱水：组织依次入30%-50%-70%-80%-95%-100%-100%酒精上行脱水每次20min，100%丙酮两次，每次15min。渗透包埋：丙酮︰812包埋剂=1︰1 37℃ 2-4h， 丙酮︰812包埋剂=1︰2 37℃渗透过夜，纯812包埋剂37℃ 5-8h。将纯812包埋剂倒入包埋板，将样品插入包埋板后37℃烤箱过夜。聚合：包埋板放于60℃烤箱聚合48h，取出树脂块备用。超薄切片：树脂块于超薄切片机60-80nm超薄切片，150目方华膜铜网捞片。染色：铜网于2%醋酸铀饱和酒精溶液避光染色8min；70%酒精清洗3次；超纯水清洗3次；2.6%枸橼酸铅溶液避二氧化碳染色8min；超纯水清洗3次，滤纸稍吸干。铜网切片放入铜网盒内室温干燥过夜。透射电子显微镜下观察，采集图像分析。 1.2 实验要求 实验前和实验后实验员需全程跟踪，以保证实验结果客观。 1.3 实验操作人员要求 实验前核对样品数量及编号***反馈。未汇报则视为一切正常。 试验后核对数据，及时反馈问题。 1.4 数据处理及资料保存 为保证项目委托方图片及数据结果电子文档进行安全备份。项目资料如无特殊需求自项目结题后保存6个月或新一年初进行清理。***